1 目的和原则
1.1 目的
为评价“清伪灵”与某一进口伪狂犬疫苗免疫诱导新流行毒株中和抗体水平的效果，筛选出适合生产使用的最佳伪狂犬疫苗，特开展本次试验。
1.2 原则
为确保试验结果的科学性与公正性，本次试验采取盲操的形式进行。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 待试的疫苗产品
疫苗编号1：硕腾“清伪灵”，由长沙硕瑞兽药有限公司提供，规格为50头份/瓶，批号为109626，有效期至2017年9月28日。
疫苗编号2：某进口伪狂犬疫苗（Bartha-K61株），规格为50头份/瓶，批号为108112，有效期至2018年9月19日。
本次试验没有设置对照组。
2.1.2 动物
本次试验选择14周龄未免疫伪狂犬疫苗的猪，并全部来源于同一生产线同一批次。参与试验的猪为20头（两个疫苗组各10头）。试验前需要采集血样做检测，确定试验场为猪伪狂犬野毒阴性场。
2.1.3 动物饲料（略）
2.1.4 设备
注射器（5、10、20、50mL）、体温计、冰盒、相机、离心管等。
2.1.5 血清抗体检测试剂盒
猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒，由美国IDEXX公司生产。
2.2 方法
2.2.1 疫苗准备
试验疫苗先由厂商送至公司药物仓库冷藏保存。试验正式开始前，由两名试验人员负责无菌分装。重新分装时采用统一的容器，容器上只能标注编号1、2，并封存好编号信息。免疫时再换两名试验人员参与免疫和记录免疫组数及数据。采完样品后交予试验人员核对盲编号后送至广东省农业科学院动物卫生研究所进行检测。
2.2.2 猪场选择
湖南某猪伪狂犬野毒阴性场。
2.2.3 猪只初选及分组
14周龄时每栏选取10头猪用于试验（去掉体重最小的和体重最大的），每头试验猪免疫一种疫苗；且注意性别比例，尽量让各种疫苗免疫的公母猪数量一致。
2.2.4 日常饲养管理
试验猪的饲养管理和其它免疫按正常要求进行，登记好蓝耳及猪瘟的免疫时间、疫苗类型和批号，另外还要登记好试验猪只的死淘详细情况和耗料量。
2.2.5 免疫分组和记录
根据各厂家的建议，疫苗按照说明书进行稀释，颈部肌肉注射，每头猪免疫2mL。首免周龄为14周龄，二次免疫周龄为18周龄，方法与剂量同首免。要求免疫人员具有熟练的注射技巧，同时记录各种疫苗免疫时的猪只应激情况及副反应。
2.2.6 免疫后临床症状及中和抗体评判
每次采血2～3mL并分离血清（并考虑到血清析出质量）。第一次采血先评估猪场是否是阴性场，采集20头16周龄商品猪的血样，检测伪狂犬gE抗体；第二次采血在免疫前一周进行，第三次采血在第一次免疫后4周进行，第四次采血在第二次免疫后4周进行。第二次，第三次，第四次采血收集血清用PRV 新流行毒株进行血清中和抗体试验。
根据试验结果，做出评判。
3 试验结果
3.1 猪伪狂犬野毒阴性猪场评判血样的检测结果
第一次送检的20头16周龄商品猪的血样检测结果见表1。
表1 16周龄生长猪伪狂犬gE抗体检测结果
| 样品编号 | 样品OD值 | 阴性均值 | 阳性均值 | S/N值 | 结果判定 |
| 1 | 0.834 | 0.988 | 0.190 | 0.844 | 阴性 |
| 2 | 0.768 | 0.988 | 0.190 | 0.777 | 阴性 |
| 3 | 0.805 | 0.988 | 0.190 | 0.815 | 阴性 |
| 4 | 0.762 | 0.988 | 0.190 | 0.771 | 阴性 |
| 5 | 0.758 | 0.988 | 0.190 | 0.767 | 阴性 |
| 6 | 0.715 | 0.988 | 0.190 | 0.723 | 阴性 |
| 7 | 0.768 | 0.988 | 0.190 | 0.777 | 阴性 |
| 8 | 0.794 | 0.988 | 0.190 | 0.803 | 阴性 |
| 9 | 0.794 | 0.988 | 0.190 | 0.803 | 阴性 |
| 10 | 0.811 | 0.988 | 0.190 | 0.821 | 阴性 |
| 11 | 0.788 | 0.988 | 0.190 | 0.797 | 阴性 |
| 12 | 0.795 | 0.988 | 0.190 | 0.804 | 阴性 |
| 13 | 0.941 | 0.803 | 0.180 | 1.172 | 阴性 |
| 14 | 0.968 | 0.803 | 0.180 | 1.206 | 阴性 |
| 15 | 0.970 | 0.803 | 0.180 | 1.208 | 阴性 |
| 16 | 0.863 | 0.803 | 0.180 | 1.075 | 阴性 |
| 17 | 0.887 | 0.803 | 0.180 | 1.105 | 阴性 |
| 18 | 0.831 | 0.803 | 0.180 | 1.035 | 阴性 |
| 19 | 0.870 | 0.803 | 0.180 | 1.084 | 阴性 |
| 20 | 0.911 | 0.803 | 0.180 | 1.135 | 阴性 |
注：S/N值≤0.6，判定为阳性；S/N值﹥0.7，判定为阴性；0.6﹤S/N值≤0.7判定为可疑。
小结：本猪场以前检测10%的母猪样品也为阴性，从这次生长猪的检测结果来看该场基本为猪伪狂犬野毒阴性场，可以确定本次试验的前提条件成立，即试验场没有感染新流行的伪狂犬毒株。
3.2 免疫前后中和抗体试验结果
第二、第三、第四次采集血样的中和抗体试验结果见表2。
表2 两种PRV疫苗免疫前后中和抗体检测结果
| 采样时间 | 某进口伪狂犬疫苗 | 清伪灵 | ||
| 编号 | 中和抗体 | 编号 | 中和抗体 | |
| 免疫前 | 1 | 0 | 11 | 0 |
| 2 | 0 | 12 | 0 | |
| 3 | 0 | 13 | 0 | |
| 4 | 0 | 14 | 0 | |
| 5 | 0 | 15 | 0 | |
| 6 | 0 | 16 | 0 | |
| 7 | 0 | 17 | 0 | |
| 8 | 0 | 18 | 0 | |
| 9 | 0 | 19 | 0 | |
| 10 | 0 | 20 | 0 | |
| 一免后4周 | 21 | 0 | 31 | 4 |
| 22 | 0 | 32 | 8 | |
| 23 | 2 | 33 | 0 | |
| 24 | 2 | 34 | 2 | |
| 25 | 0 | 35 | 8 | |
| 26 | 0 | 36 | 4 | |
| 27 | 2 | 37 | 0 | |
| 28 | 2 | 38 | 2 | |
| 29 | 0 | | | |
| 30 | 0 | | | |
| 二免后4周 | 39 | 16 | 46 | 8 |
| 40 | 16 | 47 | 8 | |
| 41 | 4 | 48 | 16 | |
| 42 | 16 | 49 | 32 | |
| 43 | 16 | 50 | 16 | |
| 44 | 16 | 51 | 16 | |
| 45 | 2 | 52 | 32 | |
| | | 53 | 8 | |
4 试验结论
免疫前检测PRV流行毒株的中和抗体，两个疫苗组的20个样品的检测结果都为0。第一次免疫后4周采血，“清伪灵”疫苗组检测了8个样品，中和抗体阳性率（中和抗体值在2倍以上）为75%，中和抗体值在8倍及以上（保护临床不发病）的样品阳性率为25%；而某进口伪狂犬疫苗组检测了10个样品，中和抗体阳性率（中和抗体值在2倍以上）为40%，无中和抗体值超过8倍的样品，这说明两个品牌疫苗在第一次免疫后诱导猪只产生的流行毒中和抗体水平差异非常显著。第二次免疫后4周采血，某进口伪狂犬疫苗组检测了7个样品，中和抗体值在8倍及以上（保护临床不发病）的样品阳性率为71%；而“清伪灵”疫苗组检测了8个样品，中和抗体值在8倍及以上（保护临床不发病）的样品阳性率为100%，也就是说免疫二次“清伪灵”后临床保护猪群不发病达100%。
那么为什么同一毒株不同厂家生产的伪狂犬疫苗免疫诱导的流行毒株中和抗体的水平差异如此之大呢？我们认为这与疫苗毒的传代代次、培养细胞、抗原质量及佐剂等诸多因素有关，所以我们必须选择可以对新流行毒株有100%保护的疫苗——硕腾“清伪灵”作为猪群免疫保护的基石，加上运用合理的生产流程、执行严格的生物安全措施等工艺与管理来控制伪狂犬，可为净化伪狂犬病打下基础。
