猪瘟（Classical Swine Fever, CSF, 或Hog Cholera, HC）首次于1810年发生在美国中西部和南部地区，是世界动物卫生组织（WOAH）要求报告的猪病，曾在全球范围内主要养猪国家流行，导致重大经济损失。目前主要出现在中南美洲、欧洲、亚洲和部分非洲地区（Sandra et al., 2017; Liani et al., 2021）。随着上个世纪50年代我国C株猪瘟活疫苗研发成功和不断改进，以及优化临床运用以后，我国猪群猪瘟临床发病率已大幅下降。为更好的利用猪瘟疫苗控制猪瘟，本文将讨论疫苗保护水平、感染和免疫现状，影响免疫效果的常见因素，以及在目前的生产和疾病流行状态下，如何进一步优化猪瘟免疫程序。
1 猪瘟疫苗及C株疫苗免疫保护优势
目前应用的猪瘟活疫苗主要来自中国的C株、日本的GPE-株、法国的Thiverval株、墨西哥的PAV-250株和菲律宾的Coronel株等，C株活疫苗是目前使用最广泛的活疫苗（Hongliang et al., 2018; Fangfang et al., 2022）。
全病毒C株活疫苗虽然被国内外广泛使用，但其免疫后诱导猪体产生的抗体和野毒感染后产生的抗体无法区分，加上过去伪狂犬病净化项目中成功运用标记疫苗和鉴别ELISA的经验，许多研究者致力于标记疫苗的研究（Marker vaccines，也称DIVA vaccines, DIVA是“the serological differentiation between infected and vaccinated animals”的缩写），以期用来配合猪瘟净化。标记疫苗有嵌合体活疫苗（如硕腾的Suvaxyn®CSF Marker、韩国的FLC-LOM-BErns）和缺失特定表位的活疫苗，载体疫苗，以及E2亚单位疫苗等。E2亚单位疫苗有杆状病毒-昆虫细胞表达系统（如TWJ-E2®）和植物表达系统表达的疫苗，以及自动组装的纳米疫苗等（Yuyin et al., 2020；Fangfang, et al., 2022）。
E2亚单位疫苗因为能够作为标记疫苗，引起了广泛的研究。研究证明E2亚单位疫苗（Porcilis® Pesti, 梅里亚公司产品，德国生产）安全、可提供临床保护和预防猪瘟病毒传播，但免疫保护力产生较晚，疫苗免疫后达到完全预防水平传播能力需要14天，特别是在早期保护和阻止通过胎盘感染方面存在缺陷，免疫母猪时，其后代存在持续感染的风险（Depner et al., 2001；Oirschot et al., 2003；Sandra et al.，2017；EMA, 2019；Dewulf et al., 2004）。为进一步提高E2亚单位疫苗的免疫效力，有研究人员在佐剂、抗原组合、抗原递呈系统方面进行了新探索（Park et al., 2020）。
我国目前主要使用的C株活疫苗是通过兔体或细胞传代的致弱活疫苗，至少具有5个显著优势：
1）遗传稳定，安全。免疫后无排毒，不返强（至少30代），疫苗毒在组织中缓慢而有限的复制（Liani et al., 2021）。
2）产生免疫保护力快。疫苗免疫后不到1天就有半数的猪只产生部分保护，3天就能足够预防直接接触传播和很大程度地迅速减少感染，5天能得到完全保护（Simon et al., 2012）。稍早的研究甚至发现，用C株活疫苗免疫当天攻毒都能预防病毒传播（Dewulf et al., 2004）。
3）免疫保护完整。成功免疫后可提供完整的临床保护和清除性免疫，能阻断母猪妊娠期通过胎盘感染胎儿而引起的后代持续性感染（Liani et al., 2021)。
4）交叉保护广。无论对哪种基因型的猪瘟野毒都能提供100%的临床保护，具有广泛的交叉保护力(Fangfang et al., 2022)。
5）免疫保护期长。成功免疫后诱导的保护力长达6~12个月，甚至终生（Hongliang et al., 2018；Liani et al., 2021）。
2 猪瘟感染和免疫现状调查
2.1 感染现状调查结果
近年来，我国猪群的猪瘟发生率已经大幅度下降，根据中国兽医简讯的通报，2010~2014年的猪瘟病例发生分别为476、268、115、28和28例，2017年仅21例（Zhou, 2019）。硕腾（北京）诊断实验室对2021年5月至2023年4月期间来自全国30个省份的299个猪场的1171个样本用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测了猪瘟病毒核酸，结果阳性场和阳性样本比例分别为6.35%和2.22%，具体各类样本检测结果如表2-1。
表2-1 qPCR检测2021.5~2023.4期间各类样本CSFV核酸阳性汇总
2.2 猪瘟疫苗免疫程序和猪瘟ELISA抗体调查结果
为进一步了解目前猪群临床实际运用猪瘟疫苗的程序及其效果，硕腾（北京）检测实验室对2021年5月至2023年4月期间送检的各阶段样本基本完整、数量基本符合要求的，来自30个省202个猪场的猪瘟疫苗免疫程序进行了分析。结果显示（图2-1和图2-2），目前母猪群普遍采用“一刀切”的方式免疫猪瘟疫苗，2~4次/年免疫的猪场占到95%；生长猪群则普遍采用两针免疫猪瘟疫苗，约占76%；也有23.8%的生长猪群免疫一针猪瘟疫苗；个别生长猪群采用三针免疫猪瘟疫苗。在一针免疫猪瘟疫苗的生长猪群中，21~28日龄、30~43日龄、55~63日龄免疫的比例分别为8%、9.4%、6.4%。
图2-1 202个场母猪群采用的免疫程序占比
图2-2 202个场生长猪群采用的各免疫程序占比
尽管目前商品化的ELISA猪瘟抗体检测试剂盒不能鉴别诊断野毒感染产生的抗体和疫苗免疫后产生的抗体，但由2.1的调查结果可知道，目前绝大部分的猪场已不存在猪瘟感染。在这种情况下，我们认为，运用商品化的ELISA猪瘟抗体检测试剂盒对猪群猪瘟抗体进行评估能够反映猪瘟疫苗接种后免疫反应的情况。据供应商提供的信息，本实验室所用猪瘟ELISA试剂盒的检测结果判读标准为：阻断率（Blocking%）≥40%，为阳性；阻断率<40%，为阴性；该ELISA试剂盒检测血清抗体值（阻断率）与中和抗体滴度呈强相关。于是本实验室对这202个猪场各生产阶段的16913份血清样本用商品化的ELISA猪瘟抗体试剂盒进行了检测，并用盒须图分析了不同免疫程序的母猪群和采用两针及21-28日龄、30-43日龄、55-63日龄等三类一针免疫程序的生长猪群各生产阶段的猪瘟抗体阳性率和样本的猪瘟抗体值（图2-3~图2-12）。
图2-3 202个场采用各免疫程序母猪群猪瘟抗体阳性率盒须图
图2-4 202个场采用各免疫程序母猪样本猪瘟抗体值盒须图
经对图2-3和图2-4分析，对现阶段母猪群的猪瘟疫苗免疫效果初步分析如下：1）调查的母猪群中猪瘟抗体阳性率最低可达50%以下，但无论采用哪种免疫程序，下四分位的母猪群的猪瘟抗体阳性率也在90%以上；2）采用各种免疫程序母猪群样本中，下四分位的样本的猪瘟抗体值（阻断率）都在70%以上。这些数据基本说明，目前绝大多数的母猪群免疫程序效果很好，少数母猪群抗体阳性率不理想，这可能和后备母猪猪瘟抗体阳性率相对较低有关。
图2-5 采用两针免疫方案的152个场生长猪群各生产阶段猪瘟抗体阳性率盒须图
图2-6 采用两针免疫方案的152个场生长猪群各生产阶段样本猪瘟抗体值盒须图
图2-7 采用21-28日龄一针免疫方案的16个场生长猪群各生产阶段猪瘟抗体阳性率盒须图
图2-8 采用21-28日龄一针免疫方案的16个场生长猪群各生产阶段样本猪瘟抗体值盒须图
图2-9 采用30-43日龄一针免疫方案的19个场生长猪群各生产阶段猪瘟抗体阳性率盒须图
图2-10 采用30-43日龄一针免疫方案的19个场生长猪群各生产阶段样本猪瘟抗体值盒须图
图2-11 采用55-63日龄一针免疫方案的13个场生长猪群各生产阶段猪瘟抗体阳性率盒须图
图2-12 采用55-63日龄一针免疫方案的13个场生长猪群各生产阶段样本猪瘟抗体值盒须图
基于上图2-5~12结果，我们对于目前生长猪群的母源抗体保护和不同免疫程序的临床反应进行总结，可得到下面几个初步的结论：
1）生长猪群如果不接种猪瘟疫苗，仍有75%猪群在6周龄时抗体阳性率在85%以上，平均阻断率在57%以上，说明多数生长猪群母源抗体的保护至少可持续6周；
2）6周龄之前免疫，多数猪群没有改变抗体阳性率下降的趋势，会促进阳性率的箱体加大（猪群间阳性率差异加大），这种趋势越早免疫越明显；
3）单针免疫时间在8周龄以后，免疫反应普遍较快，但12周龄左右箱体较大，可能与有些猪群存在影响免疫反应的因素有关；
4）只有30-43日龄和55-63日龄免疫一针的75%以上猪群在16周龄以后阳性率在70%以上；在达到这个阳性率水平之前的12周龄和14周龄，30-43日龄免疫一针的猪群阳性率箱体更窄，猪群间阳性率差异更小，可能与这个时间段接种疫苗后受猪群其他影响因素有关。两针免疫的猪群总体上也没有达到这个水平。
5）无论两针，还是一针免疫的生长猪群，总有少数生长猪群在10~20周龄阳性率较低，但免疫一针的猪群出现的可能性更小。
3 免疫效果不理想主要原因探讨
许多因素会影响猪瘟疫苗免疫效果，常见的有：猪瘟病毒持续感染状态、母源抗体、年龄、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）和其他病原、猪只自身健康状况、疫苗质量、疫苗冷链和保存、接种技术等。
3.1 持续感染的影响
研究证明，猪瘟病毒，特别是中低毒力的猪瘟病毒，在母猪妊娠中期通过胎盘感染胎儿和仔猪21日龄之前（尤其在出生后前几个小时）感染，会引起仔猪的持续感染，是导致地方性流行的重要因素。这种持续性感染引起“迟发型”猪瘟，感染的仔猪临床健康，但胸腺严重萎缩，血清中病毒滴度高，长时间带毒、散毒，无可见细胞免疫和体液免疫反应，经C株疫苗免疫后，也无ELISA特异性抗体和中和抗体反应及特异性γ干扰素分泌细胞（Specific IFN-γ producing cells）数量增多等现象，在血清和扁桃体中也无C株疫苗毒（Liani et al., 2019; Sara et al., 2015a,b）。
3.2 母源抗体的干扰
研究发现，5周龄仔猪血清中母源中和抗体滴度在64时，影响了用C株猪瘟疫苗免疫后的细胞免疫反应和体液免疫反应，免疫13天后攻毒仍无可见中和抗体反应，特异性γ干扰素分泌细胞数量也无显著上升，攻毒后有50%的猪会发热和能分离到猪瘟病毒，四分之一会发生白细胞减少现象；但是，血清中母源中和抗体滴度在32及以下的仔猪接种C株猪瘟疫苗以后13天内特异性γ干扰素分泌细胞数量显著上升，免疫13天后攻毒，仔猪得到完全保护，无发热、白细胞减少现象，也没有分离到猪瘟病毒，血清中和抗体也显著上升（Sanipa et al., 2003）。其他类似的研究也表明，血清母源中和抗体滴度在32及以下时能成功免疫C株疫苗，大于32时免疫会影响疫苗的效果（Kim et al., 1984；Suvintarakorn et al., 1993）。
3.3 年龄影响
研究发现，血清中母源中和抗体滴度都在16以下时，5周龄相对3周龄仔猪，接种C株猪瘟疫苗以后的体液免疫反应和细胞免疫反应差别明显。5周龄仔猪接种疫苗后两周血清中和抗体显著上升，而3周龄仔猪接种疫苗后十周内血清中和抗体仍呈下降趋势；在10周龄时，5周龄免疫的仔猪的特异性γ干扰素分泌细胞数量极显著高于3周龄免疫的仔猪（Mongkol et al., 2002）。其他研究也发现，在7-56日龄之间，免疫日龄越大，免疫后有免疫反应猪的比例越高（Carranza et al., 2007）。
3.4 疾病的影响
我国学者首先报道猪瘟疫苗免疫前2天感染PRRSV会影响猪瘟疫苗抗体反应，特别是免疫后3-5周的抗体反应显著较低（Hua et al., 2003）。其后有学者在免疫猪瘟疫苗前一周感染PRRSV，免疫3周后再用CSFV野毒攻毒来评估在免疫猪瘟疫苗前一周感染PRRSV对猪瘟免疫保护的影响，结果发现提前一周感染PRRSV的猪瘟免疫猪攻毒后在临床、病毒学和病理学特征上都与未免疫猪瘟疫苗组相似。于是得出结论，PRRSV急性感染期接种猪瘟疫苗会导致免疫失败（Suradhat et al., 2006）。但是，近期有报道称，猪瘟疫苗和PRRSV疫苗同时接种能诱导强的特异性的体液和细胞免疫反应（Liu et al., 2023）。
我国台湾学者研究了提前感染2型猪圆环病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）对猪瘟疫苗免疫效果的影响，他们在接种PCV2后12天接种猪瘟疫苗，然后再于疫苗接种后15天用猪瘟野毒攻毒。结果发现，PCV2抑制了CSF特异性免疫细胞增殖反应、短暂推迟了中和抗体反应，导致了临床保护不完全，攻毒后部分猪发热、出现病毒血症和排毒等问题（Huang et al., 2011）。
我国学者进一步研究了猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）和PRRSV在接种C株疫苗前一周单独感染及混合感染对猪瘟疫苗免疫效果的影响。他们在免疫C株疫苗前一周先让试验猪单独感染PPV、PRV、PRRSV和混合感染这3种病毒，接种疫苗后6天再用猪瘟石门强毒株攻毒，评估攻毒后的临床表现和猪瘟带毒情况。结果证明，所有接种了猪瘟疫苗的试验猪都没有出现任何症状，但是在猪瘟疫苗免疫前单独感染这3种病毒或这3种病毒同时感染的猪攻毒后绝大部分成为携带CSFV猪，而免疫猪瘟疫苗前没有感染这3种病毒的猪得到了完全保护，没有成为猪瘟带毒猪（Ning et al., 2011）。
3.5 疫苗和接种技术
目前在我国猪群使用的猪瘟疫苗有C株猪瘟活疫苗和E2亚单位疫苗，C株猪瘟活疫苗因为病毒培养方式和来源不同，有兔体培养的组织苗（乳兔组织苗和脾淋组织苗）和各种细胞培养的细胞苗（如原代细胞苗和ST细胞苗、SK细胞苗、BT细胞苗等传代细胞苗）。如1所述，C株猪瘟活疫苗和猪瘟E2亚单位疫苗各有优缺点，在免疫保护产生的时间、保护程度方面，C株猪瘟活疫苗被广泛认可，具有绝对优势；但猪瘟E2亚单位疫苗作为DIVA疫苗，其诱导的抗体和野毒感染后产生的抗体能够被目前的ELISA抗体检测试剂盒区分开。
另外，国外有猪瘟C株疫苗免疫后不是所有的猪都得到完全意义上保护的报道（Terpstra et al., 1988; Ilona et al., 2010），这种现象普遍被认为与研究者使用的C株疫苗毒株与我国C株有差异有关。目前生产疫苗时所用的不同的细胞系是否对C株疫苗种毒的稳定性、抗原性有影响，需要进一步研究。
一般认为，疫苗的质量、效价会影响疫苗免疫效果，抗原质量高、含量稳定、精确定量的疫苗是临床稳定免疫效果的前提。硕腾在国内上市的猪瘟C株疫苗具有额外特点：1）BT传代细胞培养C株猪瘟疫苗毒抗原遗传性能更稳定；2）疫苗中病毒数量定量准确。疫苗中猪瘟病毒数量用免疫荧光方法对病毒半数感染量进行精确定量（50% fluorescent antibody infectious dose, FAID50），每头份病毒含量应≥104.0FAID50，相对用兔体感染量（RID）和病毒培养液的数量更为准确；3）先进的生产工艺控制使疫苗抗原质量和稳定性更优秀。
其他与疫苗有关的直接影响最终疫苗接种效果的因素还包括：疫苗不恰当的冷链运输、储存以及疫苗接种技术等。
4 瑞温安®免疫程序推荐
免疫程序的制定往往基于疫苗本身及其免疫保护特点、疾病流行规律和压力以及影响免疫效果的因素而定。
考虑到猪瘟免疫保护特点、猪瘟持续性感染产生的原因及猪瘟免疫效果调查结果（见2.2），建议瑞温安®后备种猪和种猪群参考如下免疫程序：后备母猪：配种前完成2次加强免疫，间隔1个月，每次1头份；公猪和母猪群：每年2-3次，每次1头份。
上文3.4提到在免疫猪瘟疫苗前感染PPRSV、PRV、PPV会损害猪瘟疫苗效果，考虑到PRV、PPV在绝大多数阳性猪场都是在10周龄以后循环，目前的生长猪群免疫程序主要平衡母源抗体的影响和PRRSV循环时间的影响：
1）在保育期无PRRSV活跃的猪群。可结合接种疫苗前某个时间点的血清中母源中和抗体水平和母源抗体衰减规律而确定初步接种时间。例如，采集没有接种猪瘟疫苗的4周龄仔猪血样30份，检测中和抗体值，考虑到母源抗体半衰期取平均值11天（Achariya et al., 约2周；Joris et al., 2001, 7.9天）和母源中和抗体32及以下不会干扰免疫反应，可初步得出合适的免疫时间：（log24周龄时采样样本的上四分位中和抗体值-log232）×11+28。也就是如果4周龄采样样本的上四分位中和抗体值为256，则初步免疫时间为：（log2256-log232）×11+28=61日龄。如果没有条件检测中和抗体，也可通过用与中和抗体相关性高的ELISA抗体试剂盒检测ELISA抗体来推导对应的粗略中和抗体值来计算免疫日龄（Alfonso et al., 2001；Li et al., 2013；Wang et al., 2020）。
2）如果保育期像目前多数猪场一样，PRRSV在6周龄以后循环，可以在至少PRRSV循环前一周完成瑞温安®的免疫，即5-8周龄免疫（多数猪群是母源中和抗体最低的时候，Li et al., 2020）。
3）如果PRRSV循环较早，早于6周龄，建议采取措施稳定母猪群PRRSV早期排毒的同时，猪瘟免疫建议错开PRRSV感染急性期，也可以在5-8周龄免疫，只是建议免疫后4-6周要采样评估是否需要再次免疫。所以，对于目前绝大多数猪场瑞温安®可以在5-8周龄免疫，图2-9~12的结果也证明了这点。另外，如果发生猪瘟病例，可以用该疫苗进行紧急免疫（Dewulf et al., 2004）。
5 总结
本实验室通过最近两年对299个猪场的1171个样本qPCR检测猪瘟病毒核酸，以及202个猪场猪瘟免疫程序及其抗体反应结果的调查，可以发现：一方面，目前猪瘟感染率已经很低，但仍有猪群存在；另一方面，目前的猪瘟免疫程序大多数猪群基本达到要求，但也存在一些猪群的免疫后抗体表现不理想。因为运用免疫原性优秀的C株种毒，结合BT传代细胞培养、FAID50抗原含量评估，以及先进稳定的生产工艺，瑞温安®的抗原含量更精确、免疫原性更稳定。鉴于我们上文不同猪群免疫程序的抗体反应分析结果，后备种猪应在配种前完成两次加强免疫，间隔1个月；种猪群每年接种2~3次。生长猪群制定免疫程序时可结合对PRRSV、PRV、PPV在猪群循环的时间的认识和母源中和抗体的衰减规律，大多数生长猪群可在5~8周龄接种瑞温安®一次；对于PRRSV在保育期或更早循环的生长猪群，建议5~8周龄免疫瑞温安®6周后检测评估，如有必要，可以加强免疫一次；对于保育期无PRRSV循环的猪群根据中和抗体评估结果，可推迟至更晚时间免疫瑞温安®。
